[WGS 분석] QC & Trimming

WGS 분석을 위한 FASTQ 데이터 확인 후 Trimming을 진행.

 

앞의 글에서 볼 수 있듯 FastQC 결과에서 어댑터 오염도 없고 Per base sequence quality 빼고 이상이 없어서 Trimming 스킵하는 선택지도 있지만 실습을 위해 Trimming 과정 진행.

 

Trimming 과정에는 Trimmomatic 툴을 사용.

 

Trimmomatic은 일루미나 FASTQ 데이터 전처리 툴.

 

하는 일은 크게 두 가지로, 저품질 염기 제거랑 어댑터 서열 제거.

 

FastQC에서 눈으로 확인한 문제들을 실제로 고치는 툴이라고 보면 됨.

 

작동 방식은 read를 앞뒤로 훑으면서 기준 미달인 부분을 잘라냄.

 

잘라낸 후 너무 짧아진 read는 아예 버리고 paired-end 데이터는 한쪽을 버리면 반대쪽도 같이 처리해야 해서 paired/unpaired 출력이 나뉘어서 나옴.

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Trimmomatic 툴 설치

conda install -c bioconda trimmomatic

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Trimming 실행

trimmomatic PE \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/raw/SRR062634_1.fastq.gz \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/raw/SRR062634_2.fastq.gz \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_1_paired.fastq.gz \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_1_unpaired.fastq.gz \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_2_paired.fastq.gz \
  ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_2_unpaired.fastq.gz \
  LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

 

코드 내용

• PE : Paired-end 모드로 _1이랑 _2 같이 처리한다는 뜻.
• 입력 파일 2개 : raw FASTQ _1, _2
• 출력 파일 4개 : paired/unpaired 각각 2개씩 출력. paired는 양쪽 read가 둘 다 살아남은 것, unpaired는 한쪽만 살아남은 것.
• 파라미터:
  • LEADING: 3 — read 앞쪽부터 Q3 이하면 잘라냄
  • TRAILING: 3 — read 뒤쪽부터 Q3 이하면 잘라냄
  • SLIDINGWINDOW: 4:15 — 4bp 윈도우 평균이 Q15 아래로 떨어지면 그 지점부터 잘라냄. FastQC에서 떨어진 것을 확인한 뒤쪽을 자르는 핵심 파라미터.
  • MINLEN: 36 — Trimming 후 36bp 미만이면 버림. 너무 짧은 read는 정렬할 때 쓸모없음.

 

결과를 확인하면,

 

• Input: 100만 read 쌍
• Both Surviving: 970,134 (97.01%) — 양쪽 다 살아남은 것 → paired 파일로
• Forward Only: 17,896 (1.79%)  _1만 살아남은 것 → unpaired로
• Reverse Only: 9,542 (0.95%)  _2만 살아남은 것 → unpaired로
• Dropped: 2,428 (0.24%)  둘 다 버려진 것

97% 살아남았으니까 데이터 품질이 좋다고 판단할 수 있음.

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Trimming 결과 fastqc로 전후 비교

fastqc ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_1_paired.fastq.gz \
       ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/trimmed/SRR062634_2_paired.fastq.gz \
       -o ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/qc/

 

 

html 브라우저 열기

open ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/qc/SRR062634_1_paired_fastqc.html
open ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/qc/SRR062634_2_paired_fastqc.html

Trimming 전 fastqc summary

Trimming 후 fastqc summary

 

바뀐 점

• Per base sequence quality → 빨간 X에서 초록 ✅로 바뀜
• Sequence Length Distribution → 새로 주황 경고 생김

이유

• Per base sequence quality → Per base sequence quality가 통과된 건 뒤쪽 저품질 구간이 잘려서 Trimming이 제대로 되었기 때문.
• Sequence Length Distribution → Sequence Length Distribution 경고는 Basic Statistics에서 Trimming 이후 36~100bp로 길이가 달라졌다고 나오는데 잘린 정도가 read마다 달라서 길이가 균일하지 않아서 경고가 뜨는 것.

 

 

FastQC 결과중에 Per base sequence quality를 보면 Trimmed 이전에는 박스 하단이 70bp 이후부터 Q20 이하로 떨어지고 100bp 끝에서 Q2까지 내려갔었지만, Trimmed 이후로는 박스 전체가 초록 구간 안에 머물고 있어. 하단도 Q28 이상 유지되고 있음.

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Trimming 툴

Trimmomatic은 원래는 일루미나 전용으로 만들어진 툴이다.

Phred+33 인코딩이랑 일루미나 어댑터 서열 기준으로 설계됐음.

 

다른 플랫폼은 별도 툴을 사용하는데

• PacBio / Nanopore (long read) 는 NanoFilt, Filtlong 사용
• Ion Torrent 는 Cutadapt 사용

근데 Cutadapt은 일루미나에도 많이 써서 Trimmomatic 대신 쓰는 경우도 있음.

요즘은 fastp이라는 툴이 일루미나 포함 여러 플랫폼 지원하면서 속도도 빠르고 많이 쓰이는 추세라고 함.