정렬이 끝난 BAM이 있다고 바로 변이를 부를 수 있는 건 아닙니다.전처리를 거쳐야 신뢰도 높은 변이 목록(VCF)을 얻을 수 있고, 그렇게 얻은 VCF도 표기를 통일해야 다른 DB와 비교가 가능해집니다. 이 단계를 순서대로 정리합니다.GATK Best Practices 흐름sorted BAM → MarkDuplicates → BQSR → Variant Caller → VCF GATK(Genome Analysis Toolkit)는 Broad Institute에서 만든 변이 검출 툴킷으로, 여기서 다루는 MarkDuplicates, BaseRecalibrator, HaplotypeCaller/Mutect2가 모두 이 안에 포함되어 있습니다. 변이 호출 분야의 golden standard로 통합니다.Mark..

변이 호출을 시작하기 전에 GATK 가 있는지부터 확인.gatk --version GATK가 깔려 있지 않다면,conda install -c bioconda gatk4변이 호출 전 준비(GATK가 요구하는 사전 조건들을 맞추는 과정)변이 호출 전체 흐름1. GATK용 reference 인덱스 준비 (.dict 생성)2. BAM에 Read Group 있는지 확인 3. (필요시) Read Group 추가4. HaplotypeCaller 실행 ← 진짜 변이 호출5. VCF 결과 확인GATK용 reference 인덱스 준비GATK를 성공적으로 설치하고 나서 GATK가 reference에 필요로 하는 추가 인덱스를 생성해줄 필요가 있음.gatk CreateSequenceDictionary -R ~/bioinfo/..

이번 글은 WES 데이터를 분석하는 흐름을 다룹니다. WES 분석 흐름은 WGS와 전체 골격이 거의 같습니다.FASTQ로 시작해서 정렬 → 전처리 → 변이 탐지 → 필터링 → 주석 → 해석의 순서로 흘러갑니다.이 글에서는 WGS와 같은 부분은 간략하게 짚고, WES에서 달라지는 부분을 중심으로 설명합니다.전체 흐름FASTQ (R1, R2) │ FastQC, Trimmomatic/fastp ▼QC 통과한 FASTQ │ BWA-MEM ▼SAM/BAM (정렬됨) │ Picard SortSam → MarkDuplicates → GATK BQSR ▼분석 준비 완료된 BAM │ GATK HaplotypeCaller (-ERC GVCF) │ [WES 특이: -L 옵..

앞 글에서 WGS가 무엇인지 정리했습니다.이번 글은 시퀀서에서 데이터가 나온 다음, 그 데이터가 최종 변이 목록이 되기까지 어떤 단계를 거치는지 흐름을 정리합니다. WGS 분석의 표준 흐름은 Broad Institute의 GATK Best Practices를 기준으로 삼는 경우가 많습니다.전체를 한눈에 보면 이렇게 정리할 수 있습니다.[1] 시퀀싱 → FASTQ[2] QC (품질 확인)[3] 정렬 (Alignment) → BAM[4] 전처리 (중복 표시, 품질 재보정)[5] 변이 탐지 (Variant Calling) → VCF[6] 변이 필터링[7] 변이 주석 (Annotation)[8] 결과 해석 이 흐름을 하나씩 짚어보겠습니다.시퀀싱 → FASTQ시퀀서가 게놈 조각들을 읽어서 FASTQ 파일을 만들어..

gVCF는 VCF의 확장 포맷입니다.VCF와 구조는 같지만 담고 있는 정보가 다릅니다.이 차이를 이해하려면 먼저 일반 VCF의 한계를 알아야 합니다.VCF의 한계 — 변이가 없는 자리는 어떻게 되는지일반 VCF는 변이가 발견된 위치만 기록합니다.변이가 없는 자리는 파일에 아예 등장하지 않습니다.그런데 여기서 문제가 생깁니다.어떤 위치가 VCF에 없는 이유가 두 가지일 수 있기 때문입니다. 경우 1: 레퍼런스와 동일해서 변이가 없는 것 (정상)경우 2: 그 위치에 리드가 충분하지 않아서 판단 자체를 못 한 것 VCF만 보면 이 둘을 구분할 수 없습니다.특히 여러 샘플을 합쳐서 분석하는 공동 변이 탐지(joint genotyping) 에서 이 문제가 커집니다. 예를 들어 샘플 A에서 어떤 위치에 변이가 없고..

VCF는 변이 탐지 결과를 저장하는 포맷입니다.BAM에서 변이를 찾고 나면 그 결과가 VCF로 나옵니다.어떤 염색체의 어떤 위치에서 레퍼런스와 다른 염기가 발견됐는지, 그게 얼마나 신뢰할 수 있는지를 담고 있습니다. BCF는 VCF를 바이너리로 압축한 포맷입니다.SAM과 BAM의 관계와 같습니다. 담고 있는 정보는 동일하고 저장 방식만 다릅니다.VCF가 어떻게 생겼나VCF도 SAM처럼 #으로 시작하는 헤더 섹션과 변이 레코드로 나뉩니다.##fileformat=VCFv4.2##FILTER=##INFO=##FORMAT=##reference=GRCh38#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT SAMPLE1chr1 ..

FASTA란?생물학에서 다루는 가장 기본적인 데이터는 서열(sequence)입니다.DNA 서열이든, RNA 서열이든, 단백질 서열이든 결국 문자열입니다. FASTA는 이 서열 데이터를 저장하는 가장 단순하고 오래된 포맷입니다.구조는 딱 두 줄입니다.>서열의 이름과 설명ATGCATGCATGCATGC... >로 시작하는 줄이 헤더(이름표), 그 아래가 실제 서열입니다. 이름이 FASTA인 이유는 1985년에 만들어진 서열 유사도 검색 프로그램 이름에서 왔습니다.그 프로그램이 이 포맷을 사용하면서 포맷 이름이 됐습니다.FASTA의 구조>chr1 Homo sapiens chromosome 1, GRCh38NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN..