이 글은 앞서 배운 전사(Transcription)를 한 단계 더 들어가서, 실제로 그 안에서 몇 단계가 일어나는지, 그리고 각 단계가 왜 발현 조절의 지점이 되는지를 다룹니다.1. 전사는 한 번에 일어나지 않는다: 4단계 구조전사는 크게 이렇게 나뉩니다.개시(Initiation) → 일시정지(Promoter-proximal Pausing) → 신장(Elongation) → 종결(Termination) 기본편에서는 "개시 → 신장 → 종결"만 얘기했는데, 사실 개시 직후에 일시정지라는 별도 단계가 끼어 있다는 것이 최근 20~30년 사이 밝혀진 중요한 사실입니다.이게 왜 중요한지는 아래에서 설명하겠습니다.2. 개시(Initiation): RNA Pol II 혼자서는 시작 XRNA Polymerase II..

1. Central Dogma란 무엇인가Central Dogma(중심원리)는 1958년 Francis Crick이 제안한 개념으로, 세포 안에서 유전정보가 흐르는 방향을 설명합니다.DNA → RNA → Protein(저장) (전달) (기능 수행)DNA: 유전정보를 장기 저장하는 매체. 세포핵 안에 안전하게 보관됨.RNA: DNA의 정보를 복사해서 필요한 곳(리보솜)까지 전달하는 매개체.Protein: 실제로 세포의 구조를 만들고 기능(효소 작용, 신호 전달 등)을 수행하는 최종 산물.이 흐름에서 DNA→RNA를 전사(Transcription), RNA→Protein을 번역(Translation)이라고 부릅니다. 왜 "중심"이라는 이름이 붙었나: 이게 생명체 대부분에서 공통으로 적용되는 정보..

변이 목록(VCF)만 있어서는 그게 병원성인지 아닌지 알 수 없습니다.각 변이에 기능적 의미, 알려진 임상적 의미, 집단 내 빈도 정보를 붙이는 과정이 주석(annotation)이고, 이걸 종합해서 병원성 여부를 판단하는 국제 기준이 ACMG 가이드라인입니다.SnpEff — 기능 영향 예측SnpEff는 각 변이가 어느 유전자·전사체에서 어떤 효과(effect)를 내는지, 그리고 그게 얼마나 중요한지(impact)를 예측해서 붙여주는 도구입니다.effect: missense, nonsense, splice_region, frameshift 등 SO term으로 표기impact: HIGH / MODERATE / LOW / MODIFIERHGVS c./p. 표기도 자동으로 계산해서 붙여줍니다예를 들어 AIRE..

정렬이 끝난 BAM이 있다고 바로 변이를 부를 수 있는 건 아닙니다.전처리를 거쳐야 신뢰도 높은 변이 목록(VCF)을 얻을 수 있고, 그렇게 얻은 VCF도 표기를 통일해야 다른 DB와 비교가 가능해집니다. 이 단계를 순서대로 정리합니다.GATK Best Practices 흐름sorted BAM → MarkDuplicates → BQSR → Variant Caller → VCF GATK(Genome Analysis Toolkit)는 Broad Institute에서 만든 변이 검출 툴킷으로, 여기서 다루는 MarkDuplicates, BaseRecalibrator, HaplotypeCaller/Mutect2가 모두 이 안에 포함되어 있습니다. 변이 호출 분야의 golden standard로 통합니다.Mark..

BAM까지 만들었으면 이제 레퍼런스와 비교해서 어디가 다른지 찾아야 합니다.그 전에 변이가 어떤 종류로 나뉘는지, 놓치기 쉬운 함정은 뭐가 있는지, 그리고 그 변이를 어떻게 표기하는지 먼저 정리해두었습니다.변이 분류: SNV/Indel vs SV/CNV레퍼런스 대비 서열 차이는 규모에 따라 크게 둘로 나뉩니다.Sequence variants (작은 규모, 정렬로 검출)SNV(Single Nucleotide Variant): 단일 염기 치환Small indel: 수 bp 단위의 삽입/결실Structural variants(SV) (큰 규모, kb~Mb)insertion, deletioninversion(역위)duplication(중복)translocation(전좌)CNV(Copy Number Variant..

FASTQ에는 수백만 개의 read가 들어있지만, 이 자체로는 각 read가 유전체 어디서 왔는지 알 수 없습니다.이 위치를 찾는 과정이 매핑(mapping/alignment)이고, 그 결과를 담는 표준 포맷이 SAM/BAM입니다.레퍼런스 기반 정렬전체 흐름은 이렇습니다.FASTQ (위치 미상 read) + Reference(GRCh38) → BWA-MEM → SAM/BAM (정렬 위치 포함) 수백만 개의 read 각각을 레퍼런스 유전체 전체와 비교해서 가장 잘 맞는 위치를 찾아주는 작업입니다.브루트포스로 비교하면 시간이 너무 오래 걸리기 때문에, 실무에서는 레퍼런스를 미리 인덱싱해두고 빠르게 검색하는 알고리즘을 씁니다.BWA-MEMBWA(Burrows-Wheeler Aligner)는 short-read..

시퀀싱으로 얻은 데이터를 다루려면 파이프라인 각 단계에서 쓰이는 표준 텍스트 포맷을 알아야 합니다. FASTA, FASTQ, BED는 생김새가 비슷해 보여도 담고 있는 정보와 용도가 완전히 다르니 헷갈리지 않게 정리했습니다.FASTA품질 정보 없이 서열만 담는 가장 단순한 포맷입니다. 주로 레퍼런스 유전체를 표현할 때 씁니다.>chr21GATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTATGCACGCGATAGCA 구조는 두 부분입니다.헤더: >로 시작하고 그 뒤에 서열 이름(염색체명, 유전자명 등)이 온다.서열: A/C/G/T/N으로 구성되고, 보통 60~80자마다 줄바꿈된다.레퍼런스 파일은 그대로 두고 쓰기보다 인덱스를 만들..

DNA-seq 파이프라인을 이해하려면 가장 먼저 raw read가 어떻게 만들어지는지부터 알아야 합니다.시퀀싱 방식에 따라 read의 길이, 정확도, 비용이 달라지고 이게 이후 분석 전략(어떤 caller를 쓸지, depth를 얼마나 잡을지)에 그대로 영향을 줍니다.Sanger vs NGSSanger 시퀀싱1977년 개발된 1세대 시퀀싱 방법입니다.원리는 chain termination입니다. DNA를 합성하다가 형광 표지된 ddNTP(dideoxynucleotide)가 끼어들면 그 자리에서 합성이 멈춥니다.이 과정을 무작위로 반복하면 길이가 1bp씩 다른 조각들의 ladder가 만들어집니다. 이걸 전기영동으로 길이순 분리하면 짧은 조각일수록 빨리 이동하고, 각 위치의 형광색을 크로마토그램으로 읽으면 서..

검증은 생성한 VCF 파일을 GIAB truth set이랑 비교함. 검증에는 rtg-tools 이라는 툴을 활용하는데 설치를 먼저 진행.conda install -c bioconda rtg-tools 잘 설치됐는지 확인.rtg --version검증검증 실행 전 truth VCF 인덱스 생성tabix -p vcf ~/bioinfo/bi_study/wgs_practice/truth/HG001_GRCh38_GIAB_highconf_CG-IllFB-IllGATKHC-Ion-10X-SOLID_CHROM1-X_v.3.3.2_highconf_PGandRTGphasetransfer.vcf.gz 위 명령어를 통해 인덱스를 생성하고 밑과 같이 tbi 파일이 생성된 것을 확인.ls ~/bioinfo/bi_study/wgs_..

일반적인 VCF 구조크게 세 부분으로 나뉨. 1. 메타정보 (##로 시작)##fileformat=VCFv4.2##INFO=##FORMAT=##GATKCommandLine=...더보기# 실제 VCF 파일의 메타 정보##fileformat=VCFv4.2##FILTER=##FORMAT=##FORMAT=##FORMAT=##FORMAT=##FORMAT=##GATKCommandLine=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##INFO=##contig=##source=HaplotypeCaller 각 INFO, FORMAT 필드가 뭘 의미하는지 정의해두는 곳.헤더 읽는 법만 알면 어..

변이 호출을 시작하기 전에 GATK 가 있는지부터 확인.gatk --version GATK가 깔려 있지 않다면,conda install -c bioconda gatk4변이 호출 전 준비(GATK가 요구하는 사전 조건들을 맞추는 과정)변이 호출 전체 흐름1. GATK용 reference 인덱스 준비 (.dict 생성)2. BAM에 Read Group 있는지 확인 3. (필요시) Read Group 추가4. HaplotypeCaller 실행 ← 진짜 변이 호출5. VCF 결과 확인GATK용 reference 인덱스 준비GATK를 성공적으로 설치하고 나서 GATK가 reference에 필요로 하는 추가 인덱스를 생성해줄 필요가 있음.gatk CreateSequenceDictionary -R ~/bioinfo/..

앞 글에서 SAM 파일의 구조와 해석하는 방법에 대해 다룸. 지금 설명하는 BAM은 SAM이랑 내용이 완전히 동일해, 형식만 바이너리로 압축된 것.사람이 직접 못 읽고 samtools view로 변환해야 텍스트로 보임. SAM 대비 장점은 용량이 훨씬 작고, 인덱스(.bai)를 만들면 특정 위치를 랜덤 접근으로 빠르게 찾을 수 있다는 것.그래서 실제 파이프라인에서는 SAM이 아니라 BAM을 표준으로 씀.실습 과정에서도 samtools sort로 SAM을 BAM으로 변환하고 samtools index로 인덱스를 만듬. 정리하면, SAM은 사람이 읽는 텍스트, BAM은 컴퓨터가 빠르게 처리하는 압축 버전으로 내용은 같음. BAM 파일을 다룰 때 쓰는 핵심 명령어보기samtools view file.bam |..