FASTQ에는 수백만 개의 read가 들어있지만, 이 자체로는 각 read가 유전체 어디서 왔는지 알 수 없습니다.이 위치를 찾는 과정이 매핑(mapping/alignment)이고, 그 결과를 담는 표준 포맷이 SAM/BAM입니다.레퍼런스 기반 정렬전체 흐름은 이렇습니다.FASTQ (위치 미상 read) + Reference(GRCh38) → BWA-MEM → SAM/BAM (정렬 위치 포함) 수백만 개의 read 각각을 레퍼런스 유전체 전체와 비교해서 가장 잘 맞는 위치를 찾아주는 작업입니다.브루트포스로 비교하면 시간이 너무 오래 걸리기 때문에, 실무에서는 레퍼런스를 미리 인덱싱해두고 빠르게 검색하는 알고리즘을 씁니다.BWA-MEMBWA(Burrows-Wheeler Aligner)는 short-read..

시퀀싱으로 얻은 데이터를 다루려면 파이프라인 각 단계에서 쓰이는 표준 텍스트 포맷을 알아야 합니다. FASTA, FASTQ, BED는 생김새가 비슷해 보여도 담고 있는 정보와 용도가 완전히 다르니 헷갈리지 않게 정리했습니다.FASTA품질 정보 없이 서열만 담는 가장 단순한 포맷입니다. 주로 레퍼런스 유전체를 표현할 때 씁니다.>chr21GATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTATGCACGCGATAGCA 구조는 두 부분입니다.헤더: >로 시작하고 그 뒤에 서열 이름(염색체명, 유전자명 등)이 온다.서열: A/C/G/T/N으로 구성되고, 보통 60~80자마다 줄바꿈된다.레퍼런스 파일은 그대로 두고 쓰기보다 인덱스를 만들..

DNA-seq 파이프라인을 이해하려면 가장 먼저 raw read가 어떻게 만들어지는지부터 알아야 합니다.시퀀싱 방식에 따라 read의 길이, 정확도, 비용이 달라지고 이게 이후 분석 전략(어떤 caller를 쓸지, depth를 얼마나 잡을지)에 그대로 영향을 줍니다.Sanger vs NGSSanger 시퀀싱1977년 개발된 1세대 시퀀싱 방법입니다.원리는 chain termination입니다. DNA를 합성하다가 형광 표지된 ddNTP(dideoxynucleotide)가 끼어들면 그 자리에서 합성이 멈춥니다.이 과정을 무작위로 반복하면 길이가 1bp씩 다른 조각들의 ladder가 만들어집니다. 이걸 전기영동으로 길이순 분리하면 짧은 조각일수록 빨리 이동하고, 각 위치의 형광색을 크로마토그램으로 읽으면 서..

Multi-Omics는 이 분석들을 하나씩 따로 보는 게 아니라 여러 오믹스 레이어를 동시에 측정하고 통합해서 분석하는 접근입니다.개념과 분석 흐름이 긴밀하게 연결되어 있어서 이번 글은 두 파트를 함께 정리합니다.왜 Multi-Omics인가각 오믹스 분석은 생물학적 시스템의 한 단면만 봅니다.게놈(WGS/WES): 어떤 변이가 있는가 (정적 정보)전사체(RNA-seq): 지금 어떤 유전자가 얼마나 발현되는가 (동적 정보)단백질체(Proteomics): 실제로 어떤 단백질이 얼마나 있는가대사체(Metabolomics): 세포가 어떤 물질을 만들고 소비하는가에피게놈(Epigenomics): DNA 메틸화, 히스톤 변형 같은 조절 정보각 레이어는 서로 다른 정보를 줍니다.그런데 mRNA 발현량이 높아도 단백질..

앞 글에서 메타게놈 시퀀싱이 무엇인지, 16S와 샷건 두 방법의 차이를 정리했습니다. 이번 글은 두 방법 각각의 분석 흐름을 단계별로 정리합니다.16S rRNA 앰플리콘과 샷건 메타게놈은 출발점(FASTQ)은 같지만 이후 흐름이 완전히 다릅니다.16S rRNA 앰플리콘 분석 흐름FASTQ (R1, R2) │ FastQC, 품질 트리밍 ▼QC 통과한 FASTQ │ QIIME2 (DADA2 플러그인) ▼ASV 테이블 (ASV × 샘플 카운트 행렬) │ 분류 DB 매핑 (SILVA, Greengenes2) ▼분류학적 프로파일 (Taxonomic Profile) │ ├── 다양성 분석 (α-diversity, β-diversity) ├── 군집 구조 시각화 ..

WGS, WES, RNA-seq은 하나의 개체에서 DNA 또는 RNA를 추출해서 분석했습니다.Metagenome Sequencing은 다릅니다.환경에서 직접 채취한 샘플에 존재하는 모든 생물의 유전 정보를 동시에 읽는 방법입니다. 장내 미생물, 토양 속 미생물, 바닷물 속 미생물처럼 수백~수천 종의 미생물이 뒤섞여 있는 복잡한 군집을 배양 없이 직접 분석할 수 있다는 게 핵심입니다.왜 메타게놈인지(배양의 한계)전통적인 미생물학은 미생물을 배양해서 동정했습니다.그런데 자연계에 존재하는 미생물 중 실험실 배양이 가능한 종은 1% 미만으로 알려져 있습니다.나머지 99%는 배양 방법을 모르거나 특수한 환경이 필요해서 배양이 불가능합니다. 메타게놈 시퀀싱은 이 한계를 넘어섰습니다.배양 없이 샘플에서 DNA를 직접..

앞서 WGS, WES, RNA-seq은 인간 게놈을 대상으로 한 분석이었습니다.Non-human Resequencing은 인간이 아닌 생물, 즉 동물, 식물, 미생물의 게놈을 시퀀싱해서 분석하는 것입니다.Non-human Resequencing이 무엇인가 Resequencing(재시퀀싱)은 이미 레퍼런스 게놈이 존재하는 생물의 개체(또는 집단)를 다시 시퀀싱하는 것입니다.레퍼런스와 비교해서 어떤 변이가 있는지, 집단 내 유전적 다양성이 어떤지, 어떤 유전자가 자연선택을 받았는지 등을 알아내는 게 목적입니다.여기서 핵심 전제가 하나 있습니다.레퍼런스 게놈이 있어야 한다는 것입니다.레퍼런스 게놈이 없으면 — De novo Assembly레퍼런스 게놈이 없는 생물을 처음 시퀀싱하면, 리드를 어디에 붙여야 할지..

DNA가 게놈에 담긴 설계도라면, RNA는 그 설계도를 바탕으로 지금 세포가 실제로 만들고 있는 것들의 목록입니다.RNA-seq은 어떤 유전자가 얼마나 발현되고 있는지를 시퀀싱으로 측정하는 방법입니다.전사체(Transcriptome)란세포는 게놈에 있는 유전자 전부를 항상 켜두고 있지 않습니다.어떤 세포냐, 어떤 상태냐, 어떤 환경이냐에 따라 켜지는 유전자가 다릅니다.간세포와 근육세포는 거의 같은 DNA를 갖고 있지만 완전히 다른 세포인 이유가 여기 있습니다. 특정 시점에 세포 안에 존재하는 모든 RNA 분자의 집합을 전사체(Transcriptome)라고 합니다.RNA-seq은 이 전사체를 시퀀싱으로 읽어내는 기술입니다. 전사체를 알면 이런 질문에 답할 수 있습니다.이 조건에서 어떤 유전자가 많이 발현되..

WES는 Whole Exome Sequencing, 전체 엑솜 시퀀싱이라고 합니다.게놈 전체를 읽는 WGS와 달리, 게놈에서 단백질을 코딩하는 부분인 엑솜(Exome)만 골라서 읽는 방법입니다. 이 글에서는 WES가 무엇을 읽는 건지, WGS와 어떻게 다른지, 왜 WES라는 방법이 존재하는지, 어떤 상황에서 선택하는지를 정리하고 있습니다.엑솜이란엑솜(Exome)은 게놈 전체에 흩어져 있는 모든 엑손(exon)을 합친 영역입니다.엑손은 단백질을 만드는 정보가 담긴 구간이고, 인간 게놈에는 약 18만 개의 엑손이 존재합니다. 이 엑솜이 전체 게놈에서 차지하는 비율은 약 1~2%입니다.게놈 30억 bp 중 약 3000~6000만 bp 정도입니다. 그런데 중요한 사실이 있습니다. 면적은 1~2%에 불과하지만, ..

WGS는 Whole Genome Sequencing, 전장유전체 시퀀싱입니다. 한 사람(또는 한 개체)이 가진 게놈 전체를 처음부터 끝까지 읽어내는 작업입니다.이 글에서는 WGS가 정확히 무엇을 읽는 건지, 어떤 정보를 얻을 수 있는지, 언제 WGS를 선택하는지를 정리합니다.게놈 전체를 읽는 것인간 게놈은 약 30억 염기쌍(bp)입니다.WGS는 이 30억 염기쌍을 빠짐없이 읽는 걸 목표로 합니다. 여기서 "전체"라는 단어가 중요합니다.게놈에는 단백질을 만드는 부분(엑손)도 있고, 단백질을 만들지 않는 부분(인트론, 인터제닉 영역, 조절 서열)도 있습니다.흔히 비유하길 단백질 코딩 영역은 전체 게놈의 약 1~2% 정도밖에 안 됩니다.WGS는 이 약 1~2%뿐 아니라 나머지 98%까지 전부 읽습니다.이 점이..

BED는 게놈의 특정 구간을 지정하는 데 쓰는 포맷입니다.GTF가 유전자 구조를 세세하게 표현한다면, BED는 그보다 훨씬 단순하게 "이 위치부터 저 위치까지"만 표시합니다. WES에서 어느 영역을 시퀀싱했는지, ChIP-seq에서 어디에 피크가 있는지, 어떤 영역끼리 겹치는지 같은 작업에서 BED를 씁니다.구조탭으로 구분된 컬럼이고, 처음 3개만 필수입니다.chr1 10000 10500 region_A 500 + │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ └─ strand (가닥) │ │ │ │ └────── score (점수..

FASTA가 게놈 서열 자체를 담는다면, GFF3와 GTF는 그 서열 위에 어디가 유전자인지, 어디가 엑손인지를 표시하는 지도 역할을 합니다. 이 정보를 게놈 주석(annotation)이라고 합니다. RNA-seq에서 유전자 발현량을 계산할 때, 변이가 어떤 유전자의 어떤 영역에 있는지 확인할 때, 모두 이 파일을 참조합니다.왜 두 포맷이 존재하는지GFF(General Feature Format)가 먼저 만들어졌고, 이후 개선된 버전이 GFF3입니다.GTF(Gene Transfer Format)는 GFF2를 기반으로 Ensembl이 RNA-seq 분석에 맞게 변형한 포맷입니다. 결과적으로 지금은 이렇게 쓰입니다.GTF → RNA-seq 발현량 분석에서 표준 (featureCounts, STAR, Sa..