[서열분석개론] 서열 분석 - 변이의 종류와 표기법

BAM까지 만들었으면 이제 레퍼런스와 비교해서 어디가 다른지 찾아야 합니다.

그 전에 변이가 어떤 종류로 나뉘는지, 놓치기 쉬운 함정은 뭐가 있는지, 그리고 그 변이를 어떻게 표기하는지 먼저 정리해두었습니다.

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변이 분류: SNV/Indel vs SV/CNV

레퍼런스 대비 서열 차이는 규모에 따라 크게 둘로 나뉩니다.

Sequence variants (작은 규모, 정렬로 검출)

• SNV(Single Nucleotide Variant): 단일 염기 치환
• Small indel: 수 bp 단위의 삽입/결실

Structural variants(SV) (큰 규모, kb~Mb)

• insertion, deletion
• inversion(역위)
• duplication(중복)
• translocation(전좌)

CNV(Copy Number Variant)는 SV 중에서 카피 수가 변하는 경우를 말합니다.

duplication이면 카피 수 증가, deletion이면 감소입니다.

small indel은 정렬(CIGAR)로 바로 검출되지만, CNV/SV는 read depth의 변화 패턴을 봐야 검출된다는 점에서 검출 방법 자체가 다릅니다.

서열만으로 안 보이는 변이

DNA 서열(A/C/G/T) 자체는 정상인데도 유전 양상이나 발현이 달라지는 경우가 있습니다.
표준 변이 검출 파이프라인(FASTQ→VCF)으로는 이런 변이를 놓치기 때문에 따로 알아둘 필요가 있습니다.

 

UPD (Uniparental Disomy)

한 쌍의 염색체를 양쪽 부모에게서 하나씩 받는 게 정상인데, 어떤 이유(예: trisomy rescue)로 한쪽 부모에게서만 두 카피를 물려받는 경우입니다.
서열 자체는 정상으로 보이지만, Prader-Willi 증후군처럼 imprinting이 관여하는 질환에서는 유전 양상이 달라집니다.
ROH(runs of homozygosity)나 LOH(loss of heterozygosity) 패턴으로 검출한다.

메틸화(Methylation)

서열 변화 없이 CpG 메틸화로 유전자 발현을 켜고 끄는 후성유전 현상입니다.
표준 시퀀싱으로는 안 보이고, long-read 시퀀싱으로 검출하는 경우가 많습니다.

Paralog / Pseudogene 함정

유전체에는 서로 거의 똑같은 복제본(paralog, pseudogene)이 존재하는 유전자들이 있습니다.

read가 원래 유전자에서 왔는지 paralog에서 왔는지 구분이 안 되면 문제가 생깁니다.

• read가 어느 카피에서 왔는지 모호해서 MAPQ가 낮게 나옴
• 실제로는 없는 변이를 있는 것처럼 잘못 부르거나(false positive), 반대로 진짜 변이를 놓침(masking)
• gene conversion(유전자 변환)으로 카피 수 자체가 달라지기도 함

대표적인 예로 SMA(척수성 근위축증)와 관련된 SMN1/SMN2, Lynch 증후군과 관련된 PMS2/PMS2CL이 있습니다.

이런 영역은 short-read만으로는 한계가 있어서 long-read, paralog 특이적 분석, MLPA 같은 별도 방법을 병행하거나 MAPQ와 정렬 결과를 수동으로 검토해야 합니다.

앞서 매핑 파트에서 다뤘던 "반복 영역에서 MAPQ가 0으로 떨어지는 이유"가 바로 이 문제와 이어집니다.

read가 여러 카피에 똑같이 붙어서 위치를 하나로 특정하지 못하는 것입니다.

SO term: 변이의 기능적 영향

변이가 코돈을 바꾸면 단백질도 바뀔 수 있습니다.

이 영향을 표준화된 용어로 기술하는 게 Sequence Ontology(SO) term입니다.

SnpEff, VEP 같은 도구들이 이 용어를 공통으로 써서 서로 다른 도구·DB 간에도 같은 이름으로 소통할 수 있게 합니다.

SO term	설명	Impact
synonymous_variant	코돈이 바뀌어도 같은 아미노산 (침묵)	LOW
missense_variant	아미노산 1개가 다른 아미노산으로 치환	MODERATE
stop_gained	조기 종결코돈 발생, 단백질 절단	HIGH
frameshift_variant	indel로 코돈 프레임이 밀림	HIGH
splice_region_variant	엑손-인트론 경계 교란	다양
intron_variant	인트론 내부 변이	대체로 낮음

synonymous vs missense

코돈은 3개 염기(triplet)가 아미노산 하나를 지정하는데, 여러 코돈이 같은 아미노산을 코딩하는 경우가 많습니다(코돈 축퇴). 3번째 염기 같은 데가 바뀌어도 아미노산이 그대로면 synonymous, 다른 아미노산으로 바뀌면 missense입니다.

frameshift

3의 배수가 아닌 길이의 indel이 생기면 그 지점부터 코돈을 나누는 틀 자체가 밀립니다.
그 결과 하류의 아미노산 서열 전체가 뒤바뀝니다.

대개 조기 종결로 이어져 기능 상실(LOF)이 되지만, 드물게 새로운 기능을 얻거나(GOF) 비정상적으로 안정된 단백질이 만들어지기도 합니다.

stop_gained

아미노산 코돈이 종결코돈(STOP)으로 바뀌어서 단백질이 중간에서 끊기는 경우입니다.
대개 HIGH impact로 분류되고, 잘린 mRNA가 NMD(nonsense-mediated decay)로 분해되기도 합니다.

splicing variant

인트론을 잘라내고 엑손끼리 이어붙이는 경계(보통 GT...AG)에 변이가 생기면 exon skipping, intron retention, cryptic splice site 사용 같은 문제가 생깁니다.
엑손 구성 자체가 바뀌기 때문에 기능 영향이 큰 편입니다.

intron variant

대개 인트론(non-coding) 변이는 단백질 서열에 영향을 안 줘서 영향이 작습니다.
다만 스플라이스 부위 근처나 enhancer 같은 조절요소를 건드리면 발현량이 달라질 수 있습니다.
검출은 되지만 의미 해석이 상대적으로 어려운 부분입니다.

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HGVS 표기법

같은 변이를 어느 좌표계 기준으로 표기하느냐에 따라 형태가 달라집니다.

• g. (genomic): 염색체 상의 절대 좌표 기준. 예) chr21:44287133 G>A
• c. (coding DNA): cDNA(전사체) 기준. 예) c.463G>A
• p. (protein): 아미노산 변화. 예) p.Gly155Ser

genomic 좌표는 절대적이지만, coding DNA 기준 번호는 어떤 전사체를 쓰느냐에 따라 달라집니다.

그래서 c./p. 표기를 쓸 때는 반드시 기준 전사체 번호(NM_000383.4 같은 형태)를 함께 적어야 합니다.

같은 변이라도 기준 전사체가 다르면 번호가 달라질 수 있기 때문에, 여러 전사체 중 어떤 걸 표준으로 삼을지 정한 MANE 같은 프로젝트가 있는 이유이기도 합니다.

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정리하면, 변이 자체를 규모로 나누는 축(SNV/indel vs SV/CNV)과 그 변이가 단백질에 미치는 영향을 나누는 축(SO term)은 서로 다른 층위의 분류입니다.

여기에 표기 방식(HGVS)까지 합쳐지면 하나의 변이를 여러 각도에서 설명할 수 있게 됩니다.

다음 단계인 변이 호출(VCF 생성)과 주석 과정에서 이 개념들이 그대로 쓰입니다.