[유전체학] NGS 시퀀싱 원리

이 글을 읽기 전에

NGS 분석에서 파이프라인을 돌리다 보면 FASTQ 파일에 적힌 품질 점수가 뭔지, coverage가 왜 분석마다 다른지, Illumina 데이터와 PacBio 데이터를 왜 다른 도구로 처리하는지 궁금해지는 순간이 옵니다.

 

시퀀싱 기계 내부를 엔지니어 수준으로 이해할 필요는 없지만, 어떤 원리로 데이터가 만들어지는지를 모르면 데이터 품질 평가와 파이프라인 선택 기준을 이해하기 어렵습니다.

---

Illumina 시퀀싱 원리 — SBS (Sequencing By Synthesis)

Illumina는 현재 NGS 시장의 대부분을 차지하는 플랫폼입니다.

원리는 합성하면서 읽는다(Sequencing By Synthesis)입니다.

DNA를 복제하는 과정에서 어떤 염기가 붙는지를 형광 신호로 감지합니다.

라이브러리 제작부터 시퀀싱까지

① DNA 단편화 (Fragmentation)

게놈 DNA를 작은 조각으로 자릅니다. 초음파(sonication)나 효소(enzymatic)로 처리합니다. 조각의 목표 크기는 분석 목적에 따라 다르지만 보통 300~500bp 내외입니다.

② 어댑터 라이게이션 (Adapter Ligation)

각 DNA 조각의 양쪽 끝에 어댑터(adapter) 서열을 붙입니다. 어댑터는 세 가지 역할을 합니다.

• 플로우셀(flowcell) 표면에 DNA가 부착되는 앵커 역할
• 시퀀싱 프라이머가 결합하는 서열 제공
• 샘플 식별을 위한 인덱스(바코드) 포함

③ 클러스터 생성 (Cluster Generation)

플로우셀 표면에는 어댑터 서열에 상보적인 올리고가 촘촘히 붙어 있습니다.

라이브러리 DNA가 여기에 결합한 뒤, 브릿지 증폭(Bridge Amplification)을 통해 같은 자리에 수백~수천 개의 동일한 DNA 복사본이 군집(클러스터)을 형성합니다.

클러스터가 필요한 이유는 신호가 한 분자에서는 너무 약하기 때문입니다. 같은 서열이 여러 개 뭉쳐야 감지 가능한 형광 신호가 나옵니다.

④ SBS 시퀀싱

여기서 핵심 개념이 등장합니다. Illumina는 **가역적 종결자(Reversible Terminator)**가 달린 형광 염기를 씁니다.

• 4종류 염기(A, T, G, C)가 각각 다른 형광 색으로 표지됩니다.
• 한 번에 염기 하나만 붙을 수 있습니다. (가역적 종결자가 추가 연장을 막음)
• 붙은 염기의 형광을 카메라로 촬영합니다.
• 형광 표지와 종결자를 화학적으로 제거합니다.
• 다음 염기 붙이기 → 촬영 → 제거를 반복합니다.

이 과정을 사이클(cycle)이라 합니다.

100 사이클이면 100bp 리드가 생성됩니다.

현재 Illumina NovaSeq 기준 2×150bp(150bp짜리 리드를 양쪽에서 읽는 방식)가 표준입니다.

Illumina의 근본적인 한계

SBS 방식은 사이클을 반복할수록 오류가 누적됩니다.

이유는 두 가지입니다.

• 위상 지연(Phasing): 일부 분자에서 종결자가 완전히 제거되지 않아 다음 사이클에 뒤처짐
• 전위상(Pre-phasing): 반대로 종결자가 너무 일찍 제거되어 앞서 나감

이 때문에 리드 끝부분으로 갈수록 품질이 떨어집니다.

FASTQ에서 3' 끝 품질이 낮은 이유가 여기 있습니다.

또한 리드 길이에 근본적인 한계가 있습니다. 현재 Illumina 최대 리드 길이는 300bp 수준입니다.

게놈의 반복 서열(수백~수천 bp) 해독에 취약한 이유이며, Long-read 시퀀싱이 등장한 배경이기도 합니다.

---

리드, 페어드엔드, 인서트 사이즈

리드 (Read)

시퀀서가 DNA 한 조각의 한쪽 끝에서 읽어낸 서열입니다. Illumina에서 리드 하나의 길이는 보통 75~300bp입니다.

싱글엔드 vs 페어드엔드

싱글엔드 (Single-end, SE)

DNA 조각의 한쪽 끝만 읽습니다.

DNA 조각:  5'────────────────────3'
읽기:      →→→→→→→→  (한쪽만)

비용이 저렴하지만 리드 하나의 정보만 씁니다. 일부 RNA-seq 응용이나 소규모 분석에 씁니다.

페어드엔드 (Paired-end, PE)

DNA 조각의 양쪽 끝을 모두 읽습니다.

DNA 조각:  5'────────────────────3'
읽기:      →→→→→→  (Read 1)
                    ←←←←←← (Read 2)

같은 DNA 조각에서 나온 두 리드가 쌍(pair)을 이룹니다. WGS, WES, RNA-seq에서 대부분 페어드엔드를 씁니다. 이유는 세 가지입니다.

• 정렬 정확도 향상: 두 리드가 같은 조각에서 나왔다는 정보로 반복 서열 부근에서도 더 정확하게 정렬됩니다.
• SV 탐지: 두 리드의 방향과 거리 정보로 역위, 전좌 등 구조변이를 탐지합니다.
• Duplicate 제거: 같은 조각에서 나온 리드를 식별해 PCR 중복을 제거합니다.

인서트 사이즈 (Insert Size)

Read 1의 5' 끝부터 Read 2의 5' 끝까지의 거리, 즉 원래 DNA 조각의 길이입니다.

어댑터 서열은 포함하지 않습니다.

어댑터──[Read1]──────[INSERT]──────[Read2]──어댑터
        ←───────── Insert Size ──────────→

 

인서트 사이즈는 분석 전에 설계하는 파라미터이기도 하고, 분석 중에 확인하는 QC 지표이기도 합니다.

• WGS/WES: 보통 300~500bp 인서트 사이즈로 설계합니다.
• RNA-seq: 보통 200~400bp입니다.
• 인서트 사이즈가 너무 작으면: 두 리드가 겹쳐서 정보 손실이 생깁니다.
• 인서트 사이즈가 너무 크면: 두 리드 사이에 커버하지 못하는 구간이 생깁니다.

실제 인서트 사이즈 분포는 QC 단계에서 Picard CollectInsertSizeMetrics로 확인합니다.

분포가 예상과 크게 다르면 라이브러리 제작 문제를 의심합니다.

---

시퀀싱 깊이 (Depth / Coverage)

개념 정리

Depth(깊이) 또는 Coverage(커버리지)는 게놈의 특정 위치를 평균 몇 개의 리드가 커버했는지를 나타내는 지표입니다.

평균 깊이 = (총 리드 수 × 리드 길이) / 타깃 게놈 크기

 

예시: 30x WGS라면 게놈의 각 위치가 평균 30개의 리드에 의해 읽혔다는 의미입니다.

 

깊이가 중요한 이유는 변이를 신뢰 있게 탐지하려면 충분한 리드가 쌓여야 하기 때문입니다. 리드 하나만 변이를 보여준다면 시퀀싱 오류인지 진짜 변이인지 구분할 수 없습니다.

깊이가 실제로 어떻게 보이는가

게놈 위치:  ─────────────────────────────────
리드 1:         →→→→→→→→→→→→
리드 2:       →→→→→→→→→→→
리드 3:           →→→→→→→→→→→→→
리드 4:      →→→→→→→→→→
...
깊이:    0  5  10  30  30  30  30  10  5  0

 

게놈 양 끝이나 캡처 효율이 낮은 영역에서는 깊이가 낮아집니다. 깊이가 0인 위치는 해당 부분에 대한 정보가 전혀 없다는 의미입니다.

분석 목적별 권장 깊이

분석 목적	권장 깊이	이유
WGS (일반 germline)	30x	대부분의 germline 변이 탐지 가능
WGS (고품질 / 연구용)	60x~	희귀 변이, SV 정확도 향상
WES (germline)	100x	타깃 영역이 좁아서 더 깊게 필요
체세포 변이 (종양)	100~300x	낮은 VAF의 소수 클론 변이 탐지
cfDNA (액체생검)	1000x~	극소량의 종양 DNA 탐지
RNA-seq (bulk)	20~50M reads	깊이보다 리드 수로 표현
scRNA-seq	20~50K reads/cell	세포당 리드 수로 표현
16S 메타게놈	10~50K reads/sample	군집 다양성 포착
샷건 메타게놈	10~30G bp	총 염기 수로 표현

 

VAF(Variant Allele Frequency)와 깊이의 관계

체세포 변이 탐지에서 깊이가 중요한 이유를 구체적으로 보면 이렇습니다.

종양 세포가 전체 세포의 20%를 차지하고, 그 중 한 allele에 변이가 있다면 VAF = 10%입니다.

즉, 100개의 리드 중 10개만 변이를 보여줍니다.

이 변이를 신뢰 있게 탐지하려면 최소 수십 개의 변이 리드가 필요하므로, 전체 깊이가 100~300x 이상 필요합니다.

30x WGS에서 VAF 10% 변이를 보면 3개 리드만 변이를 지지합니다. 이건 오류인지 변이인지 구분이 불가능합니다.

Uniformity (균일도)

깊이가 충분해도 특정 영역만 몰리고 다른 영역은 낮으면 문제가 됩니다.

WES에서 캡처 효율이 낮은 영역(GC 함량이 높거나 반복 서열 부근)은 깊이가 낮아 변이를 놓칩니다.

 

QC 지표:

• % bases at 20x: 전체 타깃 영역 중 깊이 20x 이상인 비율. 높을수록 좋음.
• Fold-80 base penalty: 80%의 타깃을 커버하는 데 필요한 평균 깊이 대비 비율. 1에 가까울수록 균일한 커버리지.

---

시퀀싱 오류 패턴과 품질 점수

 

Phred Quality Score (Q Score)

시퀀서가 각 염기를 얼마나 정확하게 읽었는지를 나타내는 품질 점수입니다. FASTQ 파일에서 각 염기 바로 밑에 ASCII 문자 형태로 인코딩됩니다.

 

공식:

Q = -10 × log₁₀(P)

P = 오염기 확률 (error probability)
Q = Phred quality score

 

직관적으로 보면 이렇습니다.

Q Score	오류 확률	정확도	의미
Q10	1/10 (10%)	90%	나쁨
Q20	1/100 (1%)	99%	최소 기준
Q30	1/1000 (0.1%)	99.9%	좋음 (일반 기준)
Q40	1/10000 (0.01%)	99.99%	매우 좋음

 

분석에서 보통 Q30 이상을 신뢰 가능한 염기로 봅니다. FastQC에서 확인하는 "Per base sequence quality" 그래프가 이 Q score 분포를 보여줍니다.

FASTQ 파일 구조

@SRR001666.1 HWI-EAS225:1:1:4:1690/1     ← 리드 헤더 (@ 로 시작)
GTTGCTTCTGGCGTGGGTGGGGGGG                ← 염기 서열
+                                         ← 구분자
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII                ← 품질 점수 (ASCII 인코딩)

 

품질 점수 ASCII 인코딩 방식: Phred+33 방식이 현재 표준입니다.

ASCII 코드에서 33을 뺀 값이 Q score가 됩니다.

 

예시: I의 ASCII 값은 73 → 73 - 33 = Q40

Illumina의 주요 오류 패턴

1. 리드 끝부분 품질 저하 (3' quality drop)

위에서 설명한 phasing/pre-phasing 문제로 리드 끝으로 갈수록 품질이 낮아집니다.

Trimmomatic, Cutadapt 같은 도구로 품질 낮은 3' 끝을 트리밍합니다.

2. 특정 시퀀스 맥락 오류 (Context-specific errors)

GGG 같은 동형 염기 반복(homopolymer) 구간이나 GC 함량이 매우 높은 부분에서 오류가 증가합니다.

3. 어댑터 오염 (Adapter contamination)

인서트 사이즈가 리드 길이보다 짧으면, 리드가 인서트를 읽고 나서 어댑터 서열까지 읽어버립니다.

이 경우 리드에 어댑터 서열이 포함되는데, 이걸 그대로 정렬하면 정렬이 안 되거나 잘못됩니다.

Trimmomatic, fastp으로 제거합니다.

4. PCR 중복 (PCR Duplicates)

라이브러리 제작 중 PCR 증폭 과정에서 동일한 DNA 조각이 여러 번 복사됩니다.

이 중복 리드들은 독립적인 시퀀싱 증거가 아니기 때문에 변이 탐지에서 편향을 일으킵니다.

Picard MarkDuplicates, samtools markdup으로 식별하고 제거합니다.

일반적으로 WGS에서 duplicate rate이 10~20% 이하면 양호합니다.

5. 산화 손상 (Oxidative damage, 8-oxoG)

DNA 산화 손상으로 G가 T로 잘못 읽히는 오류입니다. C→A transversion 형태로 나타납니다.

FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매) 샘플에서 특히 흔합니다.

GATK의 BaseRecalibrator(BQSR)가 이런 체계적 오류를 보정합니다.

Base Quality Score Recalibration (BQSR)

시퀀서가 부여한 Q score는 절대적으로 정확하지 않습니다. 특정 시퀀스 맥락, 사이클 번호, 타일 위치에 따라 체계적으로 오류 확률이 달라집니다. BQSR은 알려진 변이 위치(dbSNP)를 제외한 나머지 위치에서 실제 오류 패턴을 분석하고 Q score를 재보정합니다. GATK Best Practices 파이프라인에서 정렬 후 필수 단계입니다.

---

Long-read 시퀀싱 — PacBio와 ONT

Illumina의 짧은 리드(~150bp)는 반복 서열, 구조변이, 복잡한 게놈 영역 분석에 한계가 있습니다.

Long-read 시퀀싱은 이 한계를 극복하기 위해 등장했습니다.

두 대표 플랫폼(PacBio, ONT)은 원리가 완전히 다릅니다.

PacBio — SMRT 시퀀싱

원리: SMRT(Single Molecule Real-Time) 시퀀싱입니다. DNA 중합효소가 실시간으로 염기를 붙이는 과정에서 나오는 형광 신호를 읽습니다.

핵심 구조는 ZMW(Zero-Mode Waveguide)입니다. 빛이 아래로만 통과하는 극히 작은 구멍인데, 여기에 DNA 중합효소 하나를 고정시킵니다. 형광 염기가 중합효소에 결합하는 순간(수 ms 수준의 아주 짧은 시간) 형광을 방출하고, 그 신호를 감지합니다.

 

특징

• 리드 길이: 평균 10~25kb, 최대 수백 kb도 가능합니다.
• 정확도: 단일 패스(CCS) 기준 >99.9% (HiFi reads)
• HiFi reads: 동일한 DNA 조각을 여러 번 순환해서 읽어 오류를 보정한 합의 서열입니다. 긴 리드이면서 높은 정확도를 동시에 달성합니다.
• DNA 메틸화 동시 검출: 메틸화된 염기에서 중합효소 속도가 달라지는 패턴으로 CpG 메틸화를 직접 감지합니다.

ONT (Oxford Nanopore Technologies) — 나노포어 시퀀싱

원리: 단백질 나노포어(nanopore)가 막에 박혀 있고, DNA가 이 구멍을 통과할 때 이온 전류가 변하는 패턴을 읽습니다. 각 염기(와 변형 염기)는 서로 다른 전류 변화 패턴을 만듭니다.

이온 전류 ────[정상]────[A 통과]────[T 통과]────[G 통과]────
                          ↓           ↓           ↓
                       전류 변화   전류 변화   전류 변화
                       패턴 A      패턴 T      패턴 G

이 전류 패턴을 딥러닝 모델(Dorado basecaller)로 염기 서열로 변환(basecalling)합니다.

 

특징

• 리드 길이: 평균 10~100kb, 이론적으로 수 Mb까지도 가능합니다.
• 정확도: 현재 최신 모델 기준 단일 리드 >99% (Q20+)
• 실시간 분석: 시퀀싱하면서 동시에 데이터를 처리할 수 있습니다. 임상 현장에서 빠른 진단이 필요할 때 유리합니다.
• 직접 RNA 시퀀싱: cDNA 변환 없이 RNA를 직접 읽을 수 있습니다. RNA 변형(m6A 등)까지 감지 가능합니다.
• 휴대성: MinION 장비는 USB 연결로 작동하는 소형 기기입니다. 병원, 현장, 우주정거장에서도 사용된 사례가 있습니다.
• 염기 변형 감지: 메틸화, 하이드록시메틸화 등 다양한 염기 변형을 추가 실험 없이 직접 감지합니다.

PacBio vs ONT 비교

항목	PacBio HiFi	ONT (최신 모델)
리드 길이	평균 10~25kb	평균 10~100kb
정확도 (단일 리드)	>99.9%	>99%
처리량	중간	높음
장비 비용	높음	낮음 (MinION 기준)
직접 RNA 시퀀싱	불가	가능
염기 변형 감지	가능 (제한적)	가능 (다양)
주요 강점	높은 정확도의 긴 리드	초장 리드, 실시간, 이동성

Long-read가 Short-read를 대체하는가

아직은 상호 보완 관계입니다.

Long-read의 약점은 비용(여전히 Short-read보다 높음), 처리량(동일 비용 대비 총 염기 수가 적음), 일부 응용(단세포 분석 등)에서의 제한입니다.

Short-read는 비용 효율이 높고, SNV/small Indel 탐지 정확도가 높으며, 처리량이 많습니다.

이 때문에 대규모 코호트 WGS, WES, RNA-seq에서는 여전히 Short-read가 주력입니다.

현재 임상 및 연구에서 자주 쓰는 전략은 Short-read로 SNV/Indel을 잡고, Long-read로 SV/반복 서열/메틸화를 추가로 분석하는 하이브리드 접근입니다.

---

전체 흐름 요약

[라이브러리 제작]
DNA 단편화 → 어댑터 라이게이션 → (PCR 증폭)
                    ↓
[시퀀싱]
Illumina SBS: 클러스터 생성 → 사이클 반복 → 형광 감지
PacBio SMRT: ZMW에서 중합효소 실시간 감지
ONT: 나노포어 통과 전류 변화 패턴 감지
                    ↓
[FASTQ 생성]
리드 서열 + Q score (Phred+33 인코딩)
                    ↓
[QC 확인 항목]
- Q30 이상 비율
- 리드 길이 분포
- 어댑터 오염 여부
- PCR duplicate rate
- Insert size 분포
- Coverage depth와 uniformity
                    ↓
[다음 단계: 정렬(Alignment)]